5月28日，由斯普鲁恩斯少将指挥的第16特混舰队离开珍珠港，两天后，由弗莱彻指挥的第17特混舰队也向预定海域进发。日本联合舰队尚未采取实质性重大行动，美国海军就已经撒开了一张无形的大网，等待日军来投了。
对于即将来临的厄运，山本似乎有所察觉。5月28日出发前，他在给情妇千代子的信中流露出不安：“29日就将起锚出征，在海上约需3周左右的时间，我将亲自指挥全军奋战。说心里话，对这次出征作战，我并不寄予多大希望。今天是纪念日，道路崎岖坎坷，已到顶点。”（纪念日指日本海军节）。
山本的话不幸言中，就在山本的潜艇警戒部队到达预定海域时，美第16、17特混舰队早就通过了。6月1日和2日，情报部门发现美军调度频繁，“大和”号甚至截获了美国航空母舰在夏威夷的信号。然而，一向嗅觉灵敏的山本对此却无动于衷，甚至于运输舰队已遭到了中途岛空军的两次袭击，也未能引起山本的警觉。
6月5日，按时到达中途岛西北240海里水域的南云舰队向岛内发起攻击。这时，南云只有18架战斗机执行空中战斗巡逻任务，庞大的舰队成了美军随时猎取的猎物。正如渊田美津雄中佐当时所描述的：“我们就像一个背着满口袋黄金，单身在森林里赶路的人，自然会引起强盗的注意。哪个强盗发现了，都会首先猛扑过来。”自信有余的南云忠一根本就不相信附近会有美国舰队。
由于岛上早有准备，南云的第一次攻击毫无收获。南云没有采纳防备敌舰袭击的建议，决定对中途岛发动第二次攻击。正当4艘航空母舰上的勤务人员匆忙为飞机换装炸弹时，中途岛对南云舰队的攻击开始了。南云的3架零式战斗机迅速投入战斗，美国海军6架攻击机或坠或逃。南云忠一轻轻地松了一口气。
恰在这时，日军4号侦察机由于走错了航线，意外地发现了美国特混舰队，并立即发回了消息。突发的敌情变化使得盲目自信又墨守成规的南云忠一吃惊不小，他拿不定主意是攻击美国舰队还是进攻中途岛，因为进攻中途岛的飞机刚装上炸弹，南云的护航飞机已经很少了。
第2航空母舰战队司令官敦促南云，应当立即攻击美国舰队，而南云却作出了暂时向北挺进，捕捉并歼灭敌机动部队的指示。这样，刚刚换上进攻中途岛炸弹的飞机不得不再次换装鱼雷和对舰炸弹，这些换下来的普通炸弹被任意搁置，最终导致了巨舰的引爆自毁。
6月5日6时25分，美国舰队的攻击开始了。然而，战斗力极强的日本零式战斗机3个小时内便击退了美军不下8次空袭。正当南云趁空袭间隙下达“第二攻击波准备起飞”命令时，美俯冲轰炸机群突然向航空母舰扑来。仅仅几分钟时间，南云的多艘舰只中弹起火，“赤城”、“加贺”、“苍龙”3艘航空母舰失去了作战能力，只剩下“飞龙”号航空母舰在山口多闻司令官的指挥下孤军奋战。
下午2点30分，美军轰炸机发动了新的攻击，山口无奈地下达了弃舰命令，并把自己绑在舰桥上沉入海底。此时，像赌红了眼的赌徒一样的山本五十六已经明白，日本失败的命运已定。21点15分，他下达了停止攻击中途岛的命令。
中途岛之战，日本海军元气大伤，共损失了4艘航空母舰，1艘重巡洋舰，322架飞机，3500多名官兵，而军事力量明显处于弱势的美国海军，却只损失1艘航空母舰，1艘驱逐舰，147架飞机和307名士兵。这一结果明显改变了太平洋日美军事力量的对比。山本五十六预谋已久的速战速决速谈判的计划彻底破产。从此，为了护卫本土和巩固对南方资源地区的占领，日本军部取消了原来的作战计划，不得不采取保守的防卫措施。相反，拥有雄厚工业基础的美国的军事力量却日益壮大。中途岛战役成了第二次世界大战的重要转折点。
中途岛战败，山本心情沮丧，懊恼万分。他在给自己亲朋及情妇们的信中不时流露出厌倦的心态。然而，被武士道精神和赌徒心理浸透了灵魂的山本五十六决不会就此消沉下去。
1942年8月，抱着报仇雪耻心理，山本五十六率全部联合舰队，再次投入在瓜达尔卡纳尔岛（以下简称瓜岛）展开的与美国太平洋舰队的决战。
8月8日，由三川中将率领的舰队首先与美舰队遭遇，由于美军的疏忽，三川舰队在夜里突然发起的袭击中大获全胜。山本意识到美国海军绝不会善罢甘休，遂率舰队主力于8月17日南下瓜岛，决心与美国决一雄雌。与此同时，负责攻取瓜岛的陆军也派出一本清直大佐率领的1000人先遣队。比海军还狂妄的陆军认为，有1000人就足以解决瓜岛问题了。他们不会想到，这时的瓜岛已经驻守了拥有各式重武器的美军精锐部队1.6万人。
海军复仇的心理与陆军轻敌的思想交织在一起，再一次把日本推向惨败的深渊。在长达半年的瓜岛争夺战中，日本共伤亡陆、海、空将士5万余人，舰艇24艘（约13万余吨位）。1943年2月，山本五十六奉命将瓜岛1.3万名日军撤回，日本侵略者已是穷途末路了。
山本似乎对日本的命运和自己的命运已经有所预感了。1943年初，他在给好友堀悌吉的信中写道：“开战以来，阵亡将士已近1.5万人，实在令人悲伤、慨叹。痛定思痛，我写下这两句诗文，以抒郁怀：兵戈声声一年去，阵亡将士若云消。”
在给原田雄熊的信中，他甚至写道：“我已做好在今后百日之内贡献余生的思想准备。”山本要以自己的行动证明他曾经说过的“以我众多部下的性命去换取大量敌人伤亡之时，即是我恶贯满盈之日”。
1943年2月，山本再次将旗舰移至更加豪华的“武藏”号。在这艘堪称世界一流的战列舰上，山本推出“伊号作战”计划，准备在南太平洋再次组织大规模的反击。谁也没曾想到，山本竟会在这次精心策划的战役中丢掉了性命。1943年4月7日，联合舰队按计划发起第一次攻击，由于日军战斗力的下降和美海军的有力防御，日军没有达到目的。为了不使山本失望，飞行队长竟然谎报战功，使山本误认为“伊号作战”旗开得胜。在以后的4天中，空中作战部队继续夸大战果。为了鼓舞士气，慰问将士，就在原计划的最后一天，即4月13号，山本突然决定视察部队。这一提议当即遭到部下的坚决反对。可是，一意孤行的山本很少听从别人的劝阻。4月18日，按照事先安排。山本率视察队伍登上了前往巴莱尔的飞机。此时，准确截获了山本行动情报的尼米兹上将早已布下了天罗地网。9点34分，在4架P－38“闪电”式战斗机的猛烈炮火下，视察人员的座机相继坠落。
美机围歼山本五十六。第二天，日军搜索部队找到了失事地点。只见山本坐在飞机的座垫上，左手握军刀，套有白色手套的右手也按在军刀上，左胸流着血。山本的军医长高田六郎少将倒卧在旁边，两具尸体都已生蛆，臭气冲天。
据后来推测，山本临死时的情景可能是：飞机坠毁后，高田还没死，他把山本拖出机舱，经过匆忙的整容后，自己也断了气。4月20日，海军少佐军医田渊义三郎写下下面的尸检报告：“左肩肿骨的中央部，有一个食指大小的子弹孔，子弹的走向是右前上方；左下颌角有一个小手指肚大小的子弹射入孔，出口在右眼外眼角，像拇指压痕一样大小……显然系因损伤主要内脏器官而致命。”
1943年5月21日，日本政府发布了山本的死讯，追授他大勋位、功一级、正三位和元帅称号。6月5日，山本的国葬仪式在东京举行。仪式之后，骨灰一分为二，一部分安葬在东乡平八郎的墓旁，一部分由他的姐姐高桥嘉寿子带回故乡长冈长兴寺。
山本五十六果然如他信中所说，在百日内就结束了自己的生命，但他在太平洋战争和珍珠港犯下的罪恶却使爱好和平的人们至今思之犹痛。